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林坚
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CN102382194
2012-03-21
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自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用
 
摘要
摘要
本发明公开了一种自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用。本发明提供了一种用于检测细胞自噬的融合蛋白,由红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3组成;所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。本发明的实验证明,本发明提供的mTagRFP-mWasabi-LC3,对荧光蛋白标签进行了关键性的改良。
 
标题
发明人: 林坚 (); 夏斌 (); 周翠红 ();
公司: ()
通信地址: 100871 北京市海淀区颐和园路5号北京大学化学与分子工程学院核磁共振中心
申请号: CN201110340885.6
申请日: 2011-11-02
分类
审查员
代理
权利要求
权利要求
 
1. 一种用于检测细胞自噬的融合蛋白,包括红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3;所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。
 
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于:
  所述融合蛋白中,所述mTagRFP蛋白、所述mWasabi蛋白和所述自噬标记蛋白LC3顺次连接;
  所述mTagRFP的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第1 231位氨基酸;
  所述mWasabi的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第235 470位氨基酸;
  所述自噬标记蛋白LC3的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第475 615位氨基酸。
 
3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白,其特征在于:
  所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白:
  1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白;
  2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。
 
4. 权利要求1 3中任一所述融合蛋白的编码基因。
 
5. 根据权利要求4所述的编码基因,其特征在于:所述融合蛋白的编码基因是下述1) 3)中任一所述基因:
  1)序列表中序列1所示的DNA分子;
  2)与1)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子;
  3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子。
 
6. 含有权利要求1 3中任一所述融合蛋白的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
 
7. 根据权利要求6所述的重组载体,其特征在于:
  所述重组载体为将权利要求1 3中任一所述融合蛋白的编码基因插入表达载体pcDNA3.1(+)中,得到表达所述融合蛋白的载体。
 
8. 根据权利要求6所述的转基因细胞系,其特征在于:所述转基因细胞系为将权利要求7所述的重组载体转入宿主细胞得到的细胞系;所述宿主细胞具体为Hela细胞系。
 
9. 权利要求6或7所述重组载体、权利要求1 3中任一所述融合蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白编码基因在制备检测细胞自噬荧光探针中的应用;
  权利要求6或7所述重组载体、权利要求1 3中任一所述融合蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白编码基因或权利要求6或8所述转基因细胞系在检测细胞自噬流和/或自噬溶酶体中的应用。
 
10. 一种检测或辅助检测待测细胞自噬流和/或自噬溶酶体的方法,包括如下步骤:
  1)将权利要求6或7所述的重组载体转入待测细胞中,得到转基因细胞系;
  2)检测步骤1)得到的转基因细胞系的荧光发光情况,若所述转基因细胞系中红色荧光斑点多于绿色荧光斑点,则所述待测细胞形成或候选形成自噬流或产生或候选产生自噬溶酶体,若所述转基因细胞系中红色荧光斑点等于绿色荧光斑点,则所述待测细胞抑制或候选抑制自噬流形成或不产生或候选不产生自噬溶酶体;
  所述检测具体为通过激光共聚焦荧光显微镜进行。
 
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